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    上海巴斯德所等利用RNA編輯策略實現對逆轉錄轉座子的編輯干預

    發布時間:2020/5/22編輯:Ma Liang 人氣:2172


      【阿儀網 實驗室動態】5月19日,Cell Discovery 在線發表了中國科學院上海巴斯德研究所研究員郝沛利用RNA編輯策略、編輯干預逆轉錄轉座子的合作研究論文:Interfering with retrotransposition by two types of CRISPR effectors: Cas12a and Cas13a。該研究利用逆轉錄病毒/逆轉錄轉座子生命周期中具有DNA和RNA兩個不同階段的特性,首次采用RNA編輯的策略,實現了對逆轉錄轉座子Tf1(類似于逆轉錄病毒的模式生物)的編輯干預。同時,該工作還第一次采用CRISPR-Cas12a對逆轉錄病原體的DNA階段進行編輯,達到了100%的編輯干預效率。

       該研究開拓了對逆轉錄病原體(包括外源的逆轉錄病毒、內源性逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子)進行編輯干預的新思路。為RNA編輯和DNA編輯技術應用于逆轉錄病毒感染阻斷、器官移植中的內源逆轉錄病毒失活和種質資源培育中的逆轉錄轉座子抑制,提供了新的技術策略和并建立了系統參數。

      近年來,CRISPR系統開始發展成為對抗逆轉錄病原體(包括外源的逆轉錄病毒、內源性逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子)非常有前途的重要技術。外源和內源性的逆轉錄病毒是引發人體疾病的嚴重起因,也是器官移植(同種和異種器官移植術)中重大的風險因素。導致疾病的著名外源和內源性逆轉錄病毒包括HIV-1、HTLV-1、HERV-K等。前期科學家嘗試用CRISPR-Cas9編輯消除病人體內的HIV-1,抑制作為器官移植供體的豬體內內源性逆轉錄病毒(ERVs),和消除水稻育種中逆轉錄轉座子Tos17的干擾,取得了一定的進展。

      雖然近年來發現的、專門靶向編輯RNA的 CRISPR第VI亞型 Cas13,為對逆轉錄病原體的編輯干預,提供了新的可能性和技術策略。由于逆轉錄病毒/逆轉錄轉座子生命周期中具有DNA和RNA兩個不同階段的特性,理論上RNA編輯的方法可以通過編輯RNA中間體,有效干預和對抗逆轉錄病原體,但這一技術策略迄今為止尚沒有被探索過。另外,近年來發現與CRISPR-Cas9類似、作用于DNA的CRISPR第V亞型Cas12a,具有一些優秀特性,包括對PAM區的不同要求、自處理產生crRNA的能力和更高的靶向效率。但到目前為止尚沒有Cas12a應用于編輯干預逆轉錄病原體的報道。本研究在以下幾個方面取得了新的進展:

      構建了Tf1逆轉錄轉座的報告系統。為了應用RNA編輯(利用Cas13a)的技術策略和Cas12對逆轉錄病原體編輯干預,郝沛課題組與合作者首先構建了Tf1逆轉錄轉座的報告系統。他們在Tf1的NEO基因中引入了反向的內含子(構建多達4種不同的內含子序列),這樣Tf1轉錄剪接后新形成的Tf1產物將不具有這些引入的內含子。然后通過設計crRNA,在實驗中特異性靶向這些新形成的不包含內含子的Tf1產物。

      首次證明RNA編輯顯著干預抑制Tf1逆轉錄轉座活性。郝沛課題組與合作者設計了Cas13靶向Tf1中間轉錄本的兩個特異位點和隨機對照的實驗,獲得了對Tf1轉座活性的16%和60%的顯著編輯抑制效果。這些結果第一次證明了RNA編輯是對逆轉錄病原體有效的干預策略。更進一步,對比Cas13a與靶標結合被激活后(由于其亂切割活性)導致原核宿主細胞生長停滯的現象,研究者沒有觀察到Tf1在真核宿主中激活導致細胞停止生長的現象。這暗示了RNA編輯技術在真核宿主的安全性,也表明Cas13a在真核細胞與細菌細胞中的作用機制有所不同。

      第一次采用CRISPR-Cas12a實現對逆轉錄病原體DNA階段進行編輯干預。通過設計Cas12a靶向Tf1逆轉錄本的多個特異位點(5個crRNA設計)和隨機對照的實驗,發現Cas12a對Tf1逆轉錄轉座的顯著編輯抑制作用(達到90%)——雖然仍有殘余的Tf1轉座發生。研究者猜測殘余的轉座活性,是由于Tf1中間產物被VLP包裝保護的結果。 所以更進一步,通過延長crRNA的表達時間,最終完全消除了殘余轉座活性,達到了100%的編輯干預效率。

      這些研究成果,開拓了對逆轉錄病毒/逆轉錄轉座子進行編輯干預的新思路和新方法。比較了RNA編輯和DNA編輯的不同作用機制,完成了兩類機制對逆轉錄病原體復制和轉座的編輯干預效果的定量分析,為新技術策略發展建立了基礎并提供了系統參數。

      該項研究工作由中科院上海巴斯德所研究員郝沛與中科院分子植物卓越創新中心合成生物學重點實驗室研究員李軒、美國密歇根大學教授王紅兵(Hongbing Wang)合作完成。張牛冰和荊新云為共同第一作者。相關工作得到國家重點研發計劃、中科院戰略先導項目和自然科學基金項目的支持。

    微信號:ayiwangapp17

    (來源: 中國科學院科技產業網 )

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